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碱性蛋白酶产生菌培养分离和酶活力测定

作者:未知

  摘 要:筛选出4种可以产生碱性蛋白酶的菌株,分别编号1,2,3,4,通过菌株的生长情况,菌落的特征等这4种菌株进行分离,进步的纯化,制备酶活力测定的标准曲线。4种菌株在25℃条件下,酶活力有大有小,最大的为168um/min左右,最小酶活力在21um/min左右。
  关键词:碱性蛋白酶;培养;分离;酶活力
  碱性蛋白酶是指PH在9-11的碱性条件下能够水解蛋白质肽键的酶类,由于其活性中心含Ser,故属于丝氨酸蛋白酶。有数据显示,全世界工业用酶每年销售额大约为1亿美元,在所有的工业用酶制剂中75%是蛋白水解酶,而蛋白酶是工业用酶中占据比例最大的酶类,大约占全世界每年总销售量的60%左右。碱性蛋白酶在食品,洗涤、丝绸、饲料、医药、环保以及制革等行业中,有着广泛的用途,因此具有很强工业与经济价值。由于微生物蛋白酶均为胞外酶,与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快捷,具有动植物蛋白酶所具有的全部特性,碱性蛋白酶比中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力,有较大耐热性,有一定的酯酶活力。因此,碱性蛋白酶研究成为蛋白酶研究的热点。
  一、实验
  1.菌株及其培养基。菌株的获得:从邢台学院餐厅附近的垃圾池旁收集土壤。牛肉膏蛋白胨斜面培养基:牛肉膏 3g,蛋白胨10g,NaCl5g,1000ml水,PH值7.4-7.6; 酪蛋白培养基:酪蛋白2.5g,酵母膏5g,琼脂10g,500ml水,PH 值9.0;
  种子培养基:葡萄糖2.5g,蛋白胨5 g,酵母膏2.5g,NaCl2.5g,500ml水,PH 值9.0;发酵培养基: 葡萄糖2.5g,蛋白胨5 g,酵母膏25g, K2HPO4 5g,MnSO4 20g,500ml水,PH 值9.0。
  2.仪器。三角瓶,高压灭菌锅,培养皿,试管,酒精灯,烧杯,电炉,滤纸,漏斗,玻璃棒,生化恒温培养箱,震荡培养箱,电子天平,722型可见分光光度计。
  3.方法
  (1)菌株的培养 。将少量取样的土壤加入无菌水进行稀释,混匀,静置,之后再进行取少量上层清液分别稀释100倍,用滴管吸取少量的稀释液在酪蛋白培养上滴加一滴,然后用玻璃环在培养基上涂布,25℃恒温培养48h。挑取产生透明圈的菌株在酪蛋白培养中进一步纯化,同时进行平板划线25℃培养,和接种到斜面培养基保存。根据平板划线菌株生长的情况,选取适宜的菌株进行振荡培养。分别挑取平板划线培养基上的菌,接种到种子培养基上进行震荡培养48h。
  (2)菌株的分离。将经纯化分离得到的菌株,点种于酪蛋白培养基中,进行初步酶活力测定,根据点种菌株的情况,分别记录4种菌株的情况。
  (3) 菌株产生酶的活力测定。 将分离得到的适宜菌株接种到100ml左右种子培养基中,28℃振荡培养24h,以5%的接种量接种到发酵培养基28℃振荡培养48h,发酵液3000r每分钟,离心15min,取上清液,采用Folin-酚法测定蛋白酶活力。
  (4)标准曲线的制定。取6支试管,标号按照下面的配比操作,加入5ml碳酸钠溶液及0.5mlFolin-酚试剂,迅速混匀,于40摄氏度恒温水浴中显色20min,取出后用流水冷却,在分光光度计上以1号管为对照测定各管的吸光度(A680),以酪氨酸浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。
  二、结果和分析
  1.菌株的筛选。经酪蛋白培养基培养后,在培养基上产生明显透明圈的只有4种菌株,将其编号为1,2,3,4号,据测量发现菌株2和3的D/d值比较大,同时也比较接近,而菌株1和4的D/d值比较小,菌株的比值最大。
  2.菌株分类。菌体特征:表面褶皱,扁平而大白色;表面光滑,小也有突起淡黄色;表面相对光滑,高耸而大黄色;菌落边缘褶皱,高耸而大白色
  3.菌株酶活力的测定。由多组数据点0.165,0.213,0.464,0.406,0.772等得出标准曲线的方程式:y=-0.036+0.0147x、25度下各菌株酶活力测定结果如下。
  三、结论与讨论
  从富含蛋白质的土壤中分离出来的4种菌株都具有产生碱性蛋白酶的能力,并对它们各自的菌落特征进行记录。经测定25度下各菌株酶活力,得知酶活力的强弱。通过实验可以获得酶活力比较高的菌株,但是还是不能满足工业等生产的实际应用。
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  通讯作者:唐蕊(教授)


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